蛋白質(zhì)就是構(gòu)成人體組織器官的支架和主要物質(zhì)，在人體生命活動中，起著重要作用，可以說沒有蛋白質(zhì)就沒有生命活動的存在。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)組成的基本單位是氨基酸

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)的兩性電離

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團，而蛋白質(zhì)中不同的氨基酸殘基連接不同的側(cè)鏈，所以蛋白質(zhì)帶有不同的電荷。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI) 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

變性的本質(zhì)破壞非共價鍵和二硫鍵，不改 變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。

造成變性的因素 如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金 屬離子及生物堿試劑等 。

脈沖場凝膠電泳

當雙鏈DNA分子超過一定的大小以后，DNA雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會達到極限，此時凝膠不能按照分子大小來篩分DNA,脈沖場電泳就解決了這一難題

脈沖電泳是在兩個不同方向的電場，周期性交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子

脈沖場凝膠電泳

1 儀器： WD-2101A脈沖電泳系統(tǒng)

2 配套試劑：脈沖電泳專用瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE

3 染料：GelRed等

在凝膠電泳中，溫度越高，DNA移動的速度越快，但是條帶的清晰度和分辨率會明顯下降。溫度過高會導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈，一般設(shè)置電泳溫度為14℃

常用緩沖液是0.5×TBE? H9812，2.2s-63.8s，19h

脈沖場電泳常見問題及解決辦法

1）凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動泵的速度太快或太慢， 調(diào)到合適的速度

2）緩沖液不流動或流速慢–檢查冷卻泵：當冷卻泵制 冷時，如果蠕動泵沒有開，會造成管道內(nèi)結(jié)冰，導(dǎo) 致管道堵塞

3）電泳條帶扭曲–流速太低，導(dǎo)致制冷不充分，或不 均一、緩沖液的體積不能太小

4）條帶變粗–減少上樣量

5）條帶拖尾或模糊–電場轉(zhuǎn)換時間不合適，優(yōu)化轉(zhuǎn)換 電場轉(zhuǎn)換時間、上樣量太高，調(diào)整樣品濃度

6）大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長電場轉(zhuǎn)換 時間

7）條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降，更換緩沖液、上 樣時樣品塊被擠碎、泵速度太慢

聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在引發(fā)劑（eg.APS）和加速劑（eg.TEMED）的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱PAGE）。

聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：

1 在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。

2 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

3 對pH和溫度變化較穩(wěn)定。

4 幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣 品分離重復(fù)性好。

5 樣品不易擴散，且用量少。

6 凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。

7 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和 電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。

聚丙烯酰胺凝膠聚合

聚合原理

1.聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的。 催化系統(tǒng)常用有兩種： 過硫酸氨—TEMED化學(xué)催化聚合系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過硫酸氨（APS，引發(fā)劑）形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反應(yīng)，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。

2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。

凝膠孔徑的可調(diào)性及性質(zhì)

1）聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度（T），以及雙體占總濃度的百分含量（C）即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的，而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加。

2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動顆粒 穿過網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān)，Bis占Acr總濃度5%時，孔徑最小。

3）凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的相對分子質(zhì)量也不同。在操作時，可根據(jù)被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標準膠)，因為生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳:

1 儀器：垂直系列電泳槽；低、中、高壓電源；恒溫循環(huán)器

2 試劑： 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、 考馬斯亮藍\硝酸銀、凝膠緩沖液、非變性上樣緩 沖液、Tris堿、甘氨酸等

聚丙烯酰胺凝膠電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 儀器：垂直系列電泳槽；低、中壓電源、恒溫循環(huán)器 2 試劑： 丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺， SDS（ 十二烷基硫 酸鈉）溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8）、0.5MTris- HCl(pH6.8）、TEMED、10%(w/v)過硫酸胺溶液、SDS- Page上樣緩沖液:（ 0.5M Tris（ pH6.8）緩沖液、甘油、 10%SDS 、二硫蘇糖醇、溴酚藍）、Tris、甘氨酸、SDS 、考馬斯亮藍 \硝酸銀等

SDS-Page，在蛋白質(zhì)裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT

巰基乙醇或DTT可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽分成單個亞單位。

SDS-PAGE時，在蛋白質(zhì)裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

PAGE據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)

連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)； 不連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。 不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，利用凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后進行分離。

樣品濃縮效應(yīng)

1） 凝膠孔徑的不連續(xù)性： 濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在 大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當進入小孔膠時，受到的阻 力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓 縮成很窄的區(qū)帶。

2） 電位梯度的不連續(xù)性： 電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低 的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶

緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

 

 

 

Tris:緩沖配對離子，維持溶液的電中性及pH值 Cl-: 在電場中遷移率快，前導(dǎo)離子(leading ion)，快離子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.8的濃縮膠緩沖體系中，甘氨酸解離度很小，因而在 電場中遷移很慢，稱為尾隨離子（trailing ion），慢離子。當進入 pH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì);因此 Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續(xù)前進。高電勢梯度不存在了，各種蛋 白質(zhì)僅會由于其分子量或構(gòu)型的不同，在一個均一的電勢梯度和pH條件 下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率的不同 被分開 大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH6.7或8.3時均帶負電荷，在電場中，都向正極移動。

分子篩效應(yīng)

大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 ，這就是分子篩效應(yīng)。

電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動率快慢順序排列成一個一個區(qū)帶。在進入分離膠時，電荷效應(yīng)仍起作用。 目前，PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣，雖然電泳過程中無濃縮效應(yīng)，但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質(zhì)、酶、核酸等活性物質(zhì)變性失活，也顯示了它的優(yōu)越性。

PAGE電泳據(jù)電泳裝置不同分為圓盤及垂直的板狀兩種

前者凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤狀，因而稱為圓盤電泳； 后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，故稱為垂直板狀電泳。兩者電泳原理完全相同。

蛋白質(zhì)進行PAGE時，常用垂直板電泳。

垂直板電泳的優(yōu)越性有：

表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。

在同一塊膠板上可同時進行10個以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。

膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。

膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描。

可進行雙向電泳。

核酸(nucleic acid)

定義：

核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。

DNA的功能

DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。

基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。

RNA的種類、分布、功能

電泳

電泳是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。 在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進行分離、分析和鑒定的基本原理。
影響泳動度的因素

1. 電場強度：

電場強度是指每厘米的電位降，也稱電位梯度(電勢梯度)。電場強度越高，則帶電顆粒泳動越快。根據(jù)電場強度的不同，電泳可分為： 常壓(100-500V)電泳。其電場強度為2-10V/cm。分離時間較長，從數(shù)小時到數(shù)十小時 ，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。如我廠生產(chǎn)的DYY-6D、 6C、 8C等 高壓(2000-10000V)電泳。其電場強度為50-200V/cm，電泳時間很短，有時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。如DYY-15D、 DYY-12型、 DYY-12C、 DYY-10C、 DYY-11型

2 溶液的性質(zhì)

1)PH值

溶液的PH決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶靜電荷的量。對蛋白質(zhì)而言，溶液pH值離等電點越遠，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。因此分離某種蛋白質(zhì)混合液時，應(yīng)選擇合適的pH,使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的差異

2)離子強度

溶液的離子強度一般在0.02-0.2之間，電泳較合適。若離子強度過高，則會降低顆粒泳動速度；若離子強度過低，則緩沖能力差，往往會因為溶液PH值的變化而影響泳動度的速率

 

3)溶液黏度

泳動度與溶液黏度是成反比關(guān)系

3 顆粒性質(zhì)

顆粒直徑、形狀以及所帶靜電荷量對泳動度有較大的影響。一般來說，顆粒的靜電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就越快。反之，則越慢

4 電滲

電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。當支持物不是絕對惰性物質(zhì)時，常會因為支持物上存在的離子基團如羧基、羥基等吸附電極溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液層相對帶電，向負極移動，反之，若支持物的離子基團吸附溶液中的負離子，則溶液層向正極移動。電滲作用會影響顆粒的泳動度，因此，在電泳時，電滲小些為好。

5 焦耳熱 電泳時會產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)粘度下降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高會使樣品中的生物大分子變性失活，因此電泳時，要控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。如我廠生產(chǎn)的DYCZ-24EN,DYCZ-24F,均具有冷卻循環(huán)裝置,可與WD-9412A型恒溫循環(huán)器配套使用

Q=I2Rt

Q-釋放出的熱量，I-電流強度，R-電阻，t-電泳時間

6.支持物

現(xiàn)代電泳多在固體支持物上進行，使樣品中的不同組分形成不同的區(qū)帶，稱區(qū)帶電泳。電泳結(jié)束后，支持物可以方便地進行染色等后續(xù)處理。 對支持物的一般要求是均勻，吸附力和電滲小，機械性能好，便于染色或紫外光下檢測，故透明較好，無紫外吸收。常用支持物有濾紙，醋酸纖維素薄膜，淀粉凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠等 支持物性質(zhì)不同也會影響泳動速率，如瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不同的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒的泳動速率快，反之則慢。

標準模式(ST)：定時到時只報警不關(guān)輸出
定時模式(Time)：定時到時既報警并且關(guān)輸出
伏時模式(VH)：輸出不論在何種穩(wěn)態(tài)下只有在電壓( 伏) 與工作時間
( 小時) 的乘積(VH) 達到設(shè)定值時才報警并關(guān)輸出
分步模式(Step)：輸出按步(1-9 步) 及模式 ( 定時或伏時) 分別設(shè)定及執(zhí)行
過載保護(OverLoad!)：輸出達到一定值且負載接近短路狀態(tài)時加以 保護
空載保護(NoLoad!)：負載接近開路狀態(tài)且輸出電壓較高時加以保護
變載保護：正常工作時限制負載劇烈變化引起的不良影響
過壓保護(Overrun_U)：輸出電壓超過極限時加以保護
過流保護(Overrun_I)：輸出電流超過極限時加以保護
過功率保護(Overrun_P)：輸出功率超過極限時加以保護
短路保護(Short!)：輸出端短路且輸出電流達到一定值時加以保護
外殼漏電保護(GND-Leak)：輸出電極與外殼相連并使其帶電時加以保護

對于分子量大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成

瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別

瓊脂是由瓊脂糖（agarose）和瓊脂果膠（agaropectin）組成的。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)混合物。它們的結(jié)構(gòu)相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠能力差。 在瓊脂糖制備過程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團，就會造成電內(nèi)滲，電內(nèi)滲對質(zhì)點的移動產(chǎn)生影響。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內(nèi)滲比較小，通常在0.13%以下。 簡言之，瓊脂糖是從瓊脂中精細提取的，有自身獨特的性質(zhì)，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。

瓊脂糖凝膠電泳：實驗原理

1.DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。

2.DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。

3.DNA 分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。

瓊脂糖凝膠電泳

1. 根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1× TAE或0.5×TBE。 注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。

2. 根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。

3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖應(yīng)注意：瓊脂糖充分完全溶解，否則，會造成電泳圖像模糊不清。加熱時如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時間不宜過長。

4.使溶液冷卻至60℃左右，如需要可在此時加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻——不提倡使用。 注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時，請戴用手套。溴化乙錠在可見光下會分解。

5.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在5－8 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(>60℃)，會使得水分 過分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。

6.在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進行電泳。 注意：凝膠不立即使用時，用保鮮膜將凝膠包好在4℃下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存2～5 天。

瓊脂糖凝膠電泳

1 儀 器：水平電泳儀、中低壓電泳儀電源、凝膠成像 分析系統(tǒng) 2 配套試劑：

（1）介 質(zhì)：瓊脂糖凝膠

（2）緩沖液：TAE緩沖溶液（Tris堿、乙二胺四乙酸 二鈉二水、冰乙酸） TBE緩沖溶液（ Tris堿、乙二胺四乙酸 二鈉二水、硼酸）

（3）上樣緩沖液： 6×DNA Loading Buffer（DNA樣 品專用包含：EDTA、甘油、二甲苯青 、溴酚藍）

（4）染 料： EB\ Gelred \ goldview \ GenGreen \ GenView \SYBRGreen等熒光染料

5 耗材： 滅菌的白槍頭、黃槍頭、藍槍頭、200ul\500ul\1.5ml離 心管等 6 DNA Marker 根據(jù)待測物分子量來定

瓊脂糖凝膠電泳緩沖液

有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳 Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（TAE) Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE) Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE)

瓊脂糖凝膠緩沖液

瓊脂糖凝膠緩沖液

三者之中，TAE的緩沖能力最低，雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%,對于高分子量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。用于分析復(fù)雜基因組的Southern印跡均用TAE電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。

瓊脂糖凝膠緩沖液

TBE可以使用2-3次左右，而TAE用1-2次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。 電泳緩沖液剛好沒過凝膠1-2mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。

瓊脂糖凝膠上樣緩沖液

上樣緩沖液是上樣時與樣品一起加入泳道的。上樣緩沖液有三個作用：

1）增加樣品密度；

2）使樣品帶有顏色，便于上樣操作；

3）其中的指示劑在電場中以可以預(yù)測的泳動速率 向陽極遷移。 上樣緩沖液有幾種，但使用的指示劑基本都包括溴酚藍和二甲苯氰FF。

瓊脂糖凝膠上樣緩沖液

溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無關(guān)； 在0.5×TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍的速率約與長約300bp的線性雙鏈DNA相同，在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會變化。 含有的甘油可以加大樣品的密度，使其大于TAE的濃度而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔

1） Acr及Bis的純度：應(yīng)選用分析純的Acr及Bis，如試劑不純，含有雜質(zhì)或丙烯酸時，則凝膠聚合不均一，或聚合時間延長甚至不聚合， 因而需進一步純化。 Acr和Bis貯液的pH值為4.9-5.2，當pH值的改變大于0.4pH單位則不能使用，因在偏酸或偏堿的環(huán)境中，它們可不斷水解放出丙烯酸和NH4+ 而引起pH值改變，從而影響凝膠聚合。 因此，配制的Acr和Bis貯液應(yīng)置棕色瓶中，4℃貯存 ，存放期一般不超過1-2個月為宜。

2）AP、核黃素、TEMED：增加AP和TEMED可加快聚合速率，但過量的AP和TEMED會引起電泳時燒膠和譜帶變形。應(yīng)選擇合適的配方使聚合在40-60min內(nèi)完成。

3）pH：堿性條件下聚合快，但堿性過強時膠硬而脆，需高pH時應(yīng)減少AP和TEMED用量，制酸性膠可加AgNO3等促進聚合。

4）溫度：溫度高聚合快，但高濃度凝膠聚合時易產(chǎn)生小氣泡，低溫(5℃)聚合凝膠會變得脆而混濁，一般25-35℃聚合較好。

5）氧分子：氧分子阻礙凝膠聚合，故不含SDS的凝膠先抽真空脫氣，再加引發(fā)劑。

聚丙烯酰胺凝膠電泳

PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。 聚丙烯酰胺凝膠電泳又有以下幾種：

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

連續(xù)密度梯度電泳

聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳

聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳 （DNA序列分析）

1 儀器： PCR擴增儀（96孔）、序列分析電泳槽：DYCZ-20C\DYCZ-20G、高壓電源：DYY-10C或DYY-12型 水平搖床（WD-9405D）、電子天平 (精確1毫克) 、移液槍：WD-2108 、雙顯磁力攪拌器、高壓蒸汽滅菌鍋、pH計、水浴鍋、高速臺式冷凍離心機、微型離心機：WD-2105A/B等

2 實驗試劑： 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、Tris堿、10×Buffer、 dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、去離子甲酰胺、溴酚藍 、 二甲苯青FF、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、硼酸、尿素、 親和硅烷、剝離硅烷、四甲基乙二胺、過硫酸銨、硝酸銀 、DNA Marker(根據(jù)PCR片段大小選擇合適的Marker范圍， 如SSR實驗的范圍在100bp—400bp之間)

聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠 所謂非變性凝膠，即在凝膠中不加SDS和巰基乙醇等變性劑，這種凝膠中，蛋白質(zhì)仍保持活性，其遷移率受它的靜電荷與分子大小兩個因素的影響。因此在非變性凝膠中進行電泳是不能測得分子量的，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。 所謂變性凝膠，即在凝膠中加入變性劑，如尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、巰基乙醇、DTT等。這些變性劑可以破壞或改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，把絕大部分蛋白質(zhì)分離成組成它們的亞基。同時在蛋白質(zhì)分子周圍包圍了大量負電荷。這種電荷基本上掩蓋了無變性劑存在時正常就有的任何電荷。蛋白質(zhì)在這種變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對數(shù)成直線關(guān)系。因此利用變性凝膠進行電泳可以測得蛋白質(zhì)的分子量。目前應(yīng)用較多的變性劑為SDS。

常有一些新用戶在電泳儀器規(guī)格型號、配置的選擇上有些茫然，我們特作一些提示，以供購置時參考。
電泳儀電源和電泳儀組成一套電泳儀器（為與國際接軌，2004 年我單位受國家藥監(jiān)局委托主持起草的新的“電泳裝置”醫(yī)藥行業(yè)標準把原“電泳儀”與“電泳槽”兩個行標合并修訂，采用了國際通用產(chǎn)品名稱，原“電泳儀”改稱為“電泳儀電源”, 原“電泳槽”改稱為“電泳儀”）。
電泳儀電源按電壓分為超高壓5000-10000V、高壓1500-5000V、中壓500-1500V、低壓 500V 以下四種；按電流分為大電流500mA-2000mA、中電流100-500mA、小電流 100mA 以下三種；按功率分為大功率200-400W、中功率60-200W、小功率 60W 以下三種。

電泳實驗名稱 推薦電泳儀型號 推薦電泳儀電源型號
核酸電泳(DNA、RNA) DYCP-31BN/31CN 型( 迷你型)DYCP-31DN 型( 小號)
DYCP-31E/32B 型( 中號)

DYCP-32C 型( 大號)
DYY-3C 型 DYY-8C 型 DYY-6C 型DYY-6D 型DYY-6E 型 DYY-10C 型
DYY-11 型DYY-12D 型

蛋白質(zhì)電泳 DYCZ-20H 型DYCZ-24DN( 迷你型) DYCZ-25D 型DYCZ-24EN 型( 中號) DYCZ-25E 型
DYCZ-24K 型 DYCZ-24KF 型 DYCZ-24KS 型

DYCZ-24F 型( 大號) DYCP-38C 型( 醋酸膜)
DYY-3C 型DYY-8C 型 DYY-6C 型 DYY-6D 型DYY-6E 型DYY-10C 型 DYY-12型 DYY-12D 型
DNA 序列分析電泳 DYCZ-20A/20B/20C/20D/20F/20G 型 DYY-10C 型 DYY-12 型 DYY-12C 型DYY-12D 型 DYY-15D 型
等電聚焦電泳 DYCZ-27B 型( 管狀)DYCP-37B 型( 大號) DYY-16D 型 DYY-12 型 DYY-12D 型DYY-12C 型 DYY-15D 型 DYY-10C 型
轉(zhuǎn)印電泳 濕轉(zhuǎn)：DYCZ-40A/40B/40D/40F/40G/40K 型半干式：DYCP-40C/40E 型 DYY-7C 型DYY-5D 型
雙向電泳 DYCZ-26B/26C 型 DYY-16D 型 DYY-6D 型 DYY-12D 型DYY-12C 型 DYY-15D 型 DYY-10C 型
脈沖電泳 DYCP-2101A 型 DYY-2101A 型

多用途、全功能電泳儀電源為 DYY-12 型、DYY-12C 型、DYY-12D 型、DYY-15D 型電腦三恒多用電泳儀電源。其電壓高，可作包括等電聚集和DNA 序列分析電泳在內(nèi)的多種電泳；電流大，可同時帶幾個大型電泳儀，并可進行轉(zhuǎn)印電泳；功率大，可以適應(yīng)各種變化要求，用途廣泛?？梢赃x擇標準、定時、伏時和分步等模式電泳。液晶顯示屏幕比較大。

DYY- 6C 型、DYY-6D 型、DYY-6E 型、DYY-11 型、DYY-12 型、DYY-12C 型、DYY-12D 型適宜高校學(xué)生實驗和農(nóng)業(yè)種子純度檢測中樣品數(shù)量較多，一機多槽的電泳實驗。

我公司研發(fā)的DYCZ-20G 型DNA 序列分析電泳儀是高度可調(diào)的雙板測序電泳儀，實驗重復(fù)性更高，大大提高了工作效率，是用于標記實驗的經(jīng)典選擇。做引物篩選，選用DYCZ-20H 型高通量垂直電泳儀。觀察分析核酸、蛋白質(zhì)可選WD – 9403×型LED 藍白雙光源觀察儀。做核酸電泳時，可以選擇 WD-9403 系列紫外儀，以便觀察和照像。如只觀察電泳動態(tài)，可選 WD-9403E型手提型紫外燈。欲對電泳結(jié)果進行科學(xué)分析，請選用 WD-9413A/B/C 型凝膠成像分析系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光檢測 WesternLightning、ECL\ECL plus、CDP-Star、SuperSignal、CSPD、LumiGLO 等發(fā)光底物可選WD-9423B/C 型全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

如需要冷卻，請選擇 WD-9412A 型恒溫循環(huán)器。還有多種顯微（細胞）電泳系統(tǒng)等一系列優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品供選擇。歡迎使用我公司設(shè)計的WD-9420 型通用脫色染色裝置，會大幅減少電泳液使用量，既減排又經(jīng)濟，一舉多得！

感謝您的選購！

區(qū)帶電泳

是在一定的支持物上，在電場作用下，在均一的緩沖液體系，樣品中帶正或負電荷的離子分別向負或正極以不同速度移動，分離成一個個彼此隔開的區(qū)帶。這是當前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。區(qū)帶電泳按支持物的物理性狀不同，又可分為紙和其他纖維膜電泳、淀粉電泳、凝膠電泳。

等電點聚焦電泳

凝膠中加入兩性電解質(zhì)，在電場強度下形成PH梯度。樣品在電泳中，環(huán)境PH大于其PI時帶負電荷，向正極移動，環(huán)境的PH小于其PI時帶正電荷，向負極移動，當泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點位置，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。

電泳技術(shù)方法

電泳種類很多，電泳的原理基本相同，但不同的支持物或凝膠又有各自的特點。

1 紙電泳

2 薄層電泳

3 薄膜電泳

4 瓊脂糖凝膠電泳

5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

6 毛細管電泳

薄膜電泳

以醋酸纖維制成的薄膜作為支撐體的電泳稱為薄膜電泳。 醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；伞?將之溶于丙酮等有機溶劑中，即可涂布成均一細密的微孔薄膜， 厚度約以0.1-0.15mm為宜。 醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有以下優(yōu)點：

1.分離效果好。對蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無拖尾現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了定量測定的精 確性。

2.快速省時。由于親水性較濾紙小，電滲作用小，電泳時大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快，電泳時間短，一般電泳45-60min即可，加上染色、脫色，整個電泳完成僅需90min左右。

3.靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μL血清，故常用于檢測在病理情況下微量異常蛋白的改變。

4.應(yīng)用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋 白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。

5.易保存，易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后，經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡 后可制成透明的干板，有利于掃描定量及長期保存。

由于醋酸纖維素薄膜電泳操作簡單、快速、價廉。目前已廣泛用于分析檢測血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、酶、多肽及其他生物大分子。

醋酸纖維素薄膜電泳

1．儀器： 中低壓電源、 DYCP-38C電泳槽 、WD-9404型超級加樣器

2．試劑： （1）pH8.6 巴比妥緩沖液：二乙基巴比妥酸，二乙基巴比妥 鈉；

（2）染色液：麗春紅S ，三氯乙酸；

（3）漂洗液：95%乙醇，冰醋酸 ；

（4）透明液：無水乙醇，冰醋酸。

3、介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，7×9cm等

醋酸纖維素薄膜電泳注意事項:

1.粗糙面點樣. 1-2μl為宜

2.恒流電泳:電流強度0.4～0.6mA/cm

3.pH8.6 巴比妥緩沖液（離子強度0.06）

4.染色5min即可

5.固定保存：將干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡10–15分鐘后，取出貼于潔凈玻璃板上，干燥后，即為透明薄膜圖譜。